綜述了微生物測量的需求和國內(nèi)外微生物計量研究的發(fā)展現(xiàn)狀。重點介紹了微生物精準(zhǔn)測量技術(shù)研究和微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究進(jìn)展，結(jié)合實際案例詳細(xì)介紹了微生物計量在食品安全、生物制藥、生物安全防護(hù)性能評價等領(lǐng)域發(fā)揮的重要技術(shù)支撐保障作用，并展望了微生物計量技術(shù)未來的發(fā)展趨勢，旨在為后續(xù)微生物計量研究提供一定的參考與借鑒。

0引言

地球上生活著形形色色的生命，它們共同造就了這個多姿而美麗的世界。其中，有一大類微小的“地球居民”被稱為微生物，國家科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會將其定義為：個體難以用肉眼觀察的一切微小生物之統(tǒng)稱。大約70個微生物“肩并肩”排成一行，相當(dāng)于一根頭發(fā)絲的寬度。微生物雖然個頭很小但是分布非常廣泛，無論是繁華的現(xiàn)代城市、偏僻的鄉(xiāng)村田野、還是人跡罕至的高山之巔和神秘莫測的深海之底，到處都有它們的蹤跡。然而，正是這些渺小之極、默默無聞的微生物在地球上做著驚天動地的宏大事業(yè)，深遠(yuǎn)地影響著我們?nèi)祟惖纳a(chǎn)生活和周圍環(huán)境。

自古以來，人類在日常生活和生產(chǎn)實踐中，已經(jīng)覺察到微生物的生命活動及其所發(fā)生的作用。早在公元前二千多年的夏禹時期，就有儀狄釀酒的記載，說明當(dāng)時人們已經(jīng)開始利用微生物發(fā)酵來釀造美酒。在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，我國自古就有將水煮沸后飲用的習(xí)慣。明朝李時珍在《本草綱目》中指出，將病人的衣服蒸過后再穿就不會傳染上疾病，這說明人們已經(jīng)意識到對微生物消毒可以有效預(yù)防傳染病。古人在不自覺中利用微生物或者對微生物進(jìn)行消毒的例子還有很多，但始終沒有從科學(xué)層面進(jìn)行解釋。

17世紀(jì)80年代，荷蘭科學(xué)家列文虎克用他自制的顯微鏡在雨水和池塘水等里面發(fā)現(xiàn)了許多可以活動的“活的小動物”，這是人類首次觀察到微生物。然而，直到19世紀(jì)80年代，德國微生物學(xué)家羅伯特科赫發(fā)明了微生物平板分離純化技術(shù)，并經(jīng)演變成現(xiàn)如今微生物檢測最為常用的平板培養(yǎng)計數(shù)方法，微生物才真正步入了定量時代。在平板培養(yǎng)計數(shù)方法問世以來的100多年中，它一直被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”方法，并被廣泛地應(yīng)用于食品安全、臨床診斷、生物制藥和環(huán)境檢測等領(lǐng)域，已經(jīng)與人類的生產(chǎn)生活密不可分。然而，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸意識到平板培養(yǎng)計數(shù)法的諸多局限性，如檢測時間較長、不確定度較大、微生物量值無法復(fù)測以及該方法僅僅能夠培養(yǎng)和檢測自然界中的一小部分微生物等。因此，結(jié)合計量學(xué)進(jìn)行微生物的精準(zhǔn)和快速測量成為計量研究人員緊迫而艱巨的任務(wù)。

1微生物計量關(guān)鍵技術(shù)研究

微生物計量是關(guān)于微生物測量及其應(yīng)用的學(xué)科，是基于微生物特性研究其計量單位統(tǒng)一和量值準(zhǔn)確可靠的計量學(xué)分支。發(fā)展微生物計量需要研究建立微生物測量技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實現(xiàn)微生物的特性量值與標(biāo)稱特性在國家和國際范圍內(nèi)的準(zhǔn)確一致，保證測量結(jié)果最終可溯源到國際SI單位或國際公認(rèn)單位。因此，微生物計量研究需要解決三個方面的關(guān)鍵技術(shù)問題：活性表征、精準(zhǔn)測量和快速測量（簡稱為“活”、“準(zhǔn)”和“快”）。在“活”方面主要研究如何表征和保持微生物的生命活性；在“準(zhǔn)”方面是研究降低測量不確定度；在“快”方面是研究如何縮短微生物檢測時間。通過以上三方面的研究來支撐微生物測量結(jié)果可比性、時效性和溯源性。

早在2011年，國際計量局（BIPM）物質(zhì)的量咨詢委員會（CCQM）正式成立了微生物指導(dǎo)專家組（MBSG），當(dāng)時成員有22人，由美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）的Robert Kaarls任第一屆主席。2012年在MBSG下設(shè)置了微生物定量和微生物定性兩個工作組。2015年國際計量局物質(zhì)的量委員會將原先的生物分析工作組（BAWG）分成了細(xì)胞分析工作組（CAWG）、核酸分析工作組（NAWG）和蛋白質(zhì)分析工作組（PAWG），并將原先的MBSG合并到CAWG中。2016年又在CAWG內(nèi)部成立了真核細(xì)胞計數(shù)、原核細(xì)胞計數(shù)、血液中血細(xì)胞計數(shù)3個焦點組（Focus Group）。原核細(xì)胞計數(shù)焦點組主要以微生物為對象合作研究具有溯源性的微生物測量方法和組織國際計量比對，旨在全球范圍內(nèi)構(gòu)建微生物測量體系，保證微生物測量結(jié)果在國際間的等效一致，實現(xiàn)各國微生物測量結(jié)果的國際認(rèn)可。從2012年開始至今，MBSG和CAWG先后完成和正在進(jìn)行的國際微生物計量比對有3項，此外，亞太計量規(guī)劃組織（APMP）和亞洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)聯(lián)合研發(fā)組織（ACRM）也各有1項微生物計量比對正在進(jìn)行中，包括了微生物平板計數(shù)法比對、微生物流式分析法比對和微生物定性鑒定比對（見表1）。國際上目前從事微生物計量研究的機(jī)構(gòu)主要有美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）、德國聯(lián)邦物理技術(shù)研究院（PTB）、歐盟委員會聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究院（JRC-IRMM）和英國國家生物制品檢定所（NIBSC）等。由此可見，發(fā)達(dá)國家和國際區(qū)域組織均高度重視微生物計量研究工作，我國也緊跟世界微生物計量發(fā)展的腳步，并結(jié)合國內(nèi)產(chǎn)業(yè)對微生物測量的需求開展了微生物計量關(guān)鍵技術(shù)研究，并開始主導(dǎo)微生物國際計量比對，如表1所示。

1.1微生物精準(zhǔn)測量技術(shù)研究

微生物精準(zhǔn)測量技術(shù)的研究目標(biāo)是將經(jīng)典微生物培養(yǎng)計數(shù)方法的培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變?yōu)榫w標(biāo)記的非培養(yǎng)方式，將菌落計數(shù)和代謝物檢測轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信號測量方式，將人工判讀計算方式轉(zhuǎn)變?yōu)檐浖詣臃治龇绞?，從而大大提升測量精度和節(jié)省時間。美國NIST采用庫爾特計數(shù)法對工程酵母菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定量測量，德國PTB將流式分析法用于微生物耐藥性研究中微生物測量；中國計量科學(xué)研究院采用流式分析法進(jìn)行細(xì)菌活菌定量測量。

流式分析技術(shù)（Flow cytometry）是對生物粒子進(jìn)行多參數(shù)快速定量分析技術(shù)，由于微生物比細(xì)胞要小將近十倍，所以該技術(shù)最早只用于真核細(xì)胞檢測。經(jīng)過科研人員不斷的對原有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，目前流式分析技術(shù)可以實現(xiàn)微米級甚至納米級微生物測量。因此，流式分析技術(shù)以其高通量、多重標(biāo)記和高精準(zhǔn)度等優(yōu)勢成為了微生物精準(zhǔn)測量的潛在方法。采用熒光標(biāo)記抗體特異性識別目標(biāo)微生物，同時采用膜選擇通透性熒光探針（例如：碘化丙啶）表征微生物活性，其原理是碘化丙啶只可以在微生物死亡破裂后進(jìn)入內(nèi)部對其核酸進(jìn)行標(biāo)記，而當(dāng)微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整時碘化丙啶無法進(jìn)入胞內(nèi)標(biāo)記核酸，這樣就可以有效區(qū)分死活菌。將熒光標(biāo)記后的微生物加入流式分析儀中，微生物隨著儀器的液流系統(tǒng)游進(jìn)去，然后液流系統(tǒng)使微生物一個一個排成長隊依次進(jìn)入檢測區(qū)，經(jīng)過激光光源時，微生物就會被激發(fā)出特有的熒光而被探測器及時監(jiān)測到，將數(shù)據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C(jī)分析系統(tǒng)對微生物精確計數(shù)（如圖1所示）。由此可見，融合熒光標(biāo)記和流式分析技術(shù)的微生物測量方法，可實現(xiàn)微生物活菌含量的高特異、多參數(shù)測量。

目前，中國計量科學(xué)研究院已經(jīng)通過流式分析技術(shù)建立了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等多種微生物精準(zhǔn)計量方法，該方法主要有以下幾個優(yōu)勢：1）精確度高，測量不確定度可從原先大于15%降低到小于5%;2）特異性好，鑒定目標(biāo)微生物的同時可以有效區(qū)分死活菌；3）速度快、實驗操作步驟簡單，測量時間可以從幾天縮短到數(shù)小時，最短可達(dá)到30分鐘以內(nèi)。

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