1 引言

米酵菌酸是椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)生的一種可以引起食物中毒的毒素，具有強(qiáng)烈的毒性。該菌產(chǎn)生的外毒素米酵菌酸對(duì)人體的肝、腎、心、腦等重要器官均能產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，是引起人們嚴(yán)重食物中毒和死亡的主要原因。目前對(duì)米酵菌酸尚無特效解毒藥物，人們一旦中毒，病死率高達(dá)40%～100%。發(fā)酵玉米面制品、變質(zhì)鮮銀耳及其它變質(zhì)淀粉類制品是引起中毒的主要原因，常見的食品有糯米面湯圓、吊漿粑、小米或高粱米面制品、馬鈴薯粉條、甘薯淀粉等。

今年10月5日，黑龍江雞西“酸湯子”事件，九人中毒全部死亡引發(fā)關(guān)注，“罪魁禍?zhǔn)?rdquo;就是米酵菌酸。近幾年來，我國(guó)由米酵菌酸引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生。2018年7月，浙江省金華市某村民一家三人食用了含有米酵茵酸的變質(zhì)黑木耳，引起食物中毒，最終一人死亡。2014年6月，云南省文山州廣南縣村民食用含有米酵茵酸的吊漿粑加工湯圓，死亡6人。隨著食品品種、制作的多樣性，對(duì)于米酵菌酸的檢測(cè)能力以及適應(yīng)市場(chǎng)快節(jié)奏的快速檢測(cè)能力的需求與日俱增，本文就米酵菌酸在檢測(cè)技術(shù)方面的研究現(xiàn)狀以及后期方向進(jìn)行綜述，希望為后續(xù)研究提供參考。

2 米酵菌酸的前處理和檢測(cè)方法

2.1 米酵菌酸的提取凈化

米酵菌酸的提取主要是利用各種有機(jī)溶劑對(duì)樣品的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行萃取。溶劑的選擇主要取決于米酵菌酸的化學(xué)特性，米酵菌酸含有三個(gè)羧基為弱酸性有機(jī)化合物，因此采用的有機(jī)溶劑一般為甲醇、乙酸、乙腈等有機(jī)溶液及堿性溶液，同時(shí)也要考慮樣品雜質(zhì)及基質(zhì)對(duì)提取以及后續(xù)檢測(cè)步驟的影響。在使用質(zhì)譜為檢測(cè)手段的實(shí)驗(yàn)中，由于米酵菌酸容易電離出H+離子，因此多采用ESI負(fù)離子模式，在電離中基質(zhì)雖然不會(huì)影響到標(biāo)物的分離度，但是在其離子化過程中會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，從而影響標(biāo)物的峰型、定性及定量。所以在提取凈化中，針對(duì)不同樣品，采用溶劑、柱體、實(shí)驗(yàn)步驟都需要反復(fù)調(diào)試。目前國(guó)內(nèi)的較為主流的前處理方法有固相萃取法、Qu ECh ERS法。

2.1.1 固相萃取法

目前固相萃取法在米酵菌酸中的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟，通常是超聲波震蕩提取，利用SPE固相小柱進(jìn)行凈化。國(guó)內(nèi)的此類方法大同小異，針對(duì)樣品的不同，主要區(qū)別在于提取溶劑的搭配、用量、SPE的選擇。

國(guó)標(biāo)法GB5009.189-2016前處理中采用180 m L的甲醇-氨水溶液，還需靜置1 h、超聲波震蕩30分鐘、水浴、氮吹。該方法處理過程耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)、步驟繁瑣且耗費(fèi)大量有機(jī)溶劑，已經(jīng)被逐漸被淘汰。

針對(duì)銀耳樣品，周鵬等研究中以10 m L甲醇為提取劑，主要提取手段為多次超聲波震蕩，考察使用混合強(qiáng)陰離子交換柱凈化提取液，1%氨水及氨水甲醇交替淋洗。此前處理方法步驟少、有機(jī)溶劑大量減少，對(duì)儀器及溶劑的要求都極低。

基于液質(zhì)聯(lián)用手段，覃冬杰等檢測(cè)柳州螺獅粉中的米酵菌酸，研究表明樣品量10 g、甲醇濃度75%、超聲時(shí)間20 min、甲醇量50 m L為最優(yōu)提取條件，以MAX固相萃取柱為凈化條件，水與甲醇交替淋洗。

基于液質(zhì)聯(lián)用手段，曾雪芳等檢測(cè)米粉及河粉中的米酵菌酸，其采用15 m L甲醇氨水溶液提取樣品，超聲波震蕩，使用混合型陰離子交換柱凈化提取液，水與甲醇交替淋洗。

基于液質(zhì)聯(lián)用手段，王俊虎等檢測(cè)六神曲中的米酵菌酸，其采用10 m L甲醇為提取液，使用Oasis Max強(qiáng)陰離子交換柱凈化樣品，水與甲醇交替淋洗。

可見不管是國(guó)標(biāo)法還是后續(xù)的改良方法，針對(duì)不同的樣品、不同的基質(zhì)，反相固相萃取法提取米酵菌酸有一定的規(guī)律。即采用一定濃度的甲醇溶液提取，超聲波震蕩，使用混合型陰離子交換柱凈化提取液，后續(xù)的研究均證明此種前處理方式均能滿足米酵菌酸定性定量的要求。

2.1.2 Qu ECh ERS法

Qu ECh ERS包括提取和凈化2個(gè)部分，提取溶劑采用乙腈，凈化采用分散固相萃取(dispersed solid phase extraction,d-SPE)，此方法與反相固相法差別比較大，由于具有快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效、耐用、安全的諸多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于不同基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的樣品前處理。目前此法在米酵菌酸的應(yīng)用，在國(guó)內(nèi)僅有一篇論著。梁明，胡均鵬等采用乙腈-水為溶劑，d SPE EMR-Lipid吸附劑，處理樣品，研究表明當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，提取效果最好，但其實(shí)驗(yàn)步驟比上述的固相萃取法稍顯復(fù)雜。此方法提取速度快、溶劑使用量少、污染小、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便，無需良好訓(xùn)練和較高技能便可很好地完成，文中樣品為河粉，此方法在酵米面制品中米酵菌酸的檢測(cè)具有較高價(jià)值的探索性。

以上兩種方法的區(qū)別見表2。

2.1.3 生物樣本的提取

生物樣本與食品樣本材質(zhì)上具有很大的不同，因此提取方法跟上述的方法有不小的區(qū)別。

基于液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)方法，徐小民等提取血漿中的米酵菌酸，采用乙腈為提取劑，混合型強(qiáng)陰離子交換柱萃取，水與甲醇交替淋洗。

基于液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)方法，張秀堯等提取尿液中的米酵菌酸，以3%高氯酸和正己烷為提取劑，歷經(jīng)漩渦、離心、氮吹得待測(cè)液。

2.2 米酵菌酸的檢測(cè)方法

近年來針對(duì)米酵菌酸的檢測(cè)報(bào)告比較少見，因此米酵菌酸的檢測(cè)方法也比較缺乏?，F(xiàn)在主流的檢測(cè)手段有高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、熒光層析法。

2.2.1 高效液相色譜法(HPLC)

針對(duì)米酵菌酸化學(xué)特性，分子易保留于酸性環(huán)境，因此在色譜行為上，采用反相固相法，酸性流動(dòng)相，使其保留增強(qiáng)，出峰時(shí)間推遲，峰形對(duì)稱性更好。

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.189-2016[6]中色譜條件采用反相固相法，水用冰乙酸調(diào)p H至2.5，進(jìn)樣量為20μL。蘇永恒及侯佰立的高效液相色譜測(cè)定米酵菌酸均采用了此色譜條件，值得一提的是，侯佰立實(shí)驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相比例為78︰22，峰形對(duì)稱尖銳。此檢測(cè)方法進(jìn)樣量大，導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)明顯，易受樣品基質(zhì)干擾致使定性定量出現(xiàn)偏差?；诟咝б合嗌V，李紅艷等研究極管陣列檢測(cè)器結(jié)合固相萃取法快速測(cè)定食品中米酵菌酸殘留，紫外檢測(cè)器根據(jù)保留時(shí)間定性，檢測(cè)結(jié)果可能存在假陽性，極管陣列檢測(cè)器，通過保留時(shí)間和光譜掃描定性實(shí)現(xiàn)樣品定性，比以往的高效液相方法精確簡(jiǎn)單，而又比液質(zhì)法廉價(jià)，易于普及。液相色譜法有其自身的局限性，當(dāng)樣品中標(biāo)物濃度較低時(shí)，經(jīng)常檢測(cè)不出來。

2.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS)

高效液相色譜法受基質(zhì)干擾較大，液質(zhì)聯(lián)用法樣品前處理簡(jiǎn)單、進(jìn)樣量小、大大減少試劑消耗量、靈敏度高、且兼分離、定性(分子結(jié)構(gòu)信息)、定量為一體，縮短了分析時(shí)間，是現(xiàn)在科學(xué)研究中主要的檢測(cè)手段。液質(zhì)法檢測(cè)米酵菌酸，色譜中大部分采用酸性流動(dòng)相，比如0.1%甲酸溶液-乙腈、乙腈-0.1%甲酸的10 mmol/L梯度洗脫，配合反相固相法進(jìn)行分離。質(zhì)譜中，均為電噴霧離子源(ESI)、負(fù)離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；在二級(jí)質(zhì)譜中，針對(duì)米酵菌酸的結(jié)構(gòu)特性及官能團(tuán)電離穩(wěn)定性，大多數(shù)研究者選定m/z 441.3、m/z 397.2、m/z 485.1為定性離子或定量離子。值得關(guān)注的是，周鵬等[7]在對(duì)米酵菌酸的研究表明樣品進(jìn)樣量在5u L以內(nèi)時(shí)，進(jìn)樣量與目標(biāo)物響應(yīng)值呈線性關(guān)系，再次增加進(jìn)樣量，對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)值的提高量越來越少，因此選擇2 u L進(jìn)樣量，值得參考。曾雪芳等采用UPLC-MS/MS測(cè)定米粉和河粉中的米酵菌酸，色譜條件為使用混合型陰離子交換柱，以0.1%甲酸為流動(dòng)相，其研究結(jié)果表明在酸性流動(dòng)相中。米酵菌酸色譜峰峰型更好，質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)。

2.2.3 免疫層析快速檢測(cè)法(ICA)

免疫層析法的原理是將抗原或抗體包被于固相載體硝酸纖維膜上，檢測(cè)時(shí)將樣品加到試紙上的樣品墊，樣品在毛細(xì)管作用下前移與標(biāo)記探針相互作用形成復(fù)合物，可通過肉眼或?qū)柚盘?hào)采集儀器對(duì)顯色結(jié)果進(jìn)行定性或定量分析。

張小波等人使用熒光層析法開發(fā)了米酵菌酸熒光定量檢測(cè)卡。其原理是以米酵菌酸-牛血清白蛋白偶聯(lián)物作為檢測(cè)卡的包被原料，放置于硝酸纖維素膜上，然后將上海優(yōu)晶生物科技有限公司自制的BA單克隆抗體與時(shí)間分辨微球標(biāo)記放入微孔中，包被后的膜和標(biāo)記后的微孔組裝成快速檢測(cè)卡。該檢測(cè)卡的有效檢測(cè)范圍為1～100 ng/m L，可實(shí)現(xiàn)米酵菌酸現(xiàn)場(chǎng)快速定性定量檢測(cè)。但該方法制備檢測(cè)卡步驟復(fù)雜、成本高，市場(chǎng)需求不足以支撐，現(xiàn)在還沒有量產(chǎn)。

3 總結(jié)和展望

米酵菌酸耐熱性極強(qiáng)，任你煎、炸、煮、燉都不能破壞它的毒性，而其致死率極高，因此在生產(chǎn)環(huán)節(jié)、銷售環(huán)節(jié)的檢測(cè)顯得尤為重要。目前國(guó)內(nèi)米酵菌酸的試劑盒方法仍然十分缺乏，等待研發(fā)。今后，為實(shí)現(xiàn)更方便快捷、定性、定量、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求，還應(yīng)在將膠體金、酶聯(lián)免疫、免疫層析等快速檢測(cè)方法與現(xiàn)代分析技術(shù)相結(jié)合研究開發(fā)新型食品安全快速檢測(cè)技術(shù)方面努力。

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